Este complejo drama filosófico aborda las cuestiones de la voluntad y el libre albedrío humanos (en lucha contra el destino), la trascendencia simbólica, los límites impuestos por la ética social o la razón de estado.
Sus ricos personajes llegan a representar a toda la condición humana, y viven inmersos en un escepticismo ante las apariencias sensibles y lo efímero de la existencia que los conduce a abrazar la consoladora idea de que incluso en sueños se puede actuar con bondad y virtud.
Hay en ella un abundante uso de metáforas, diferentes recursos literarios y formas poéticas (romance, redondilla, silva, quintilla, décima y octavas reales), pero, en contraste, su lenguaje es sencillo.
La obra trata de un príncipe llamado Segismundo a quien, al nacer, un pronóstico astrológico le augura que destronará violentamente a su padre y será la causa de la destrucción y división de su país, Polonia. Por esta razón, su padre, el rey Basilio, decide ocultarlo en una torre alejado de todos.
La acción comienza con la llegada de la dama Rosaura (disfrazada de hombre) y su escudero Clarín a Polonia. Rosaura porta una espada de su padre, al cual no ha conocido nunca. Dicha espada le fue entregada por su madre antes de morir, a fin de que el padre pudiera reconocerla si llegara a encontrarlo. No obstante, el motivo principal del viaje de Rosaura es la búsqueda de un amante que, tras seducirla, la abandonó: Astolfo, el duque de Moscovia, sobrino del rey Basilio.
En su camino, Rosaura y Clarín hallan a Segismundo en su torre y prisión; pero Segismundo no es consciente de ser el hijo del rey de Polonia, quien le había dotado de la única compañía de un preceptor, Clotaldo, encargado de su educación y también de ocultarle su condición de príncipe heredero. Ante la intromisión de Rosaura y Clarín, Clotaldo se ve obligado a darles muerte, pero se detiene al reconocer la espada de ella.
Debido a su vestimenta masculina, Clotaldo cree que Rosaura es un hombre, creyendo que es su hijo. Clotaldo podrá dejar libres a ambos al llegarle la noticia de que el rey ha decidido probar ese día a Segismundo como "rey por un día" para confirmar los funestos augurios: si éste demostrara ser pacífico y ponderado, Basilio le cedería el trono.
El rey de Polonia ha advertido de su prueba a los aspirantes al trono, Astolfo y la princesa Estrella, que antes desconocían la existencia de otro heredero. Segismundo, narcotizado, es trasladado a palacio, y al despertar es tratado como príncipe, lo que lo sorprende sobremanera (cree estar en sueños). Más tarde, al conocer el apartamiento al que lo había confinado su padre, reacciona montando en cólera: defenestra a un criado, agrede a Astolfo y demuestra sus impulsos sexuales con Rosaura, ya con identidad de mujer y al servicio de la princesa Estrella (gracias a su padre Clotaldo). Segismundo ya se había sentido extrañamente atraído por ella en su primer encuentro, cuando aún vestía como un hombre.
